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Annexin V-FITC / PI双染凋亡检测试剂盒

简要描述:Annexin V-FITC / PI双染凋亡检测试剂盒利用细胞核染料(PI,DAPI,7-AAD)可与双链DNA特异性结合,并产生强烈的荧光,正常情况下无法透过细胞膜。由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性,DAPI可进入细胞内对DNA进行染色,与Annexin V搭配使用,可区分处于不同凋亡时期的细胞。

  • 更新时间:2022-06-10
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Annexin V-FITC / PI双染凋亡检测试剂盒

Annexin V-FITC / PI双染凋亡检测试剂盒

 

检测原理

Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸PS有高度亲和力,可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞胞膜结合,将Annexin V标记荧光染料,利用流式细胞仪检测细胞凋亡。 细胞核染料(PI,DAPI,7-AAD)可与双链DNA特异性结合,并产生强烈的荧光,正常情况下无法透过细胞膜。由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性,DAPI可进入细胞内对DNA进行染色,与Annexin V搭配使用,可区分处于不同凋亡时期的细胞。

实验操作指南步骤 

一步法

1.细胞按照实验方案进行凋亡诱导,300 g 离心 5 min,弃上清,收集细胞,PBS 洗涤一次,轻轻重悬细胞并计数。注:本品仅在悬浮培养的细胞中验证,良好的细胞状态是实验的关键。贴壁生长的细胞用于凋亡检测时,可能会因为胰酶消化、吹打等处理导致细胞的坏死或凋亡,对实验结果可能存在不可控的影响,请谨慎处理。

 2.取 1~5 × 105重悬的细胞,300 g 离心 5 min,弃上清。用 PBS 洗涤细胞一次,离心后弃上清,加入 500 μL 稀释的 1 × Annexin V Binding Buffer 工作液重悬细胞。 

3.细胞悬液中加入 5 μL 的 Annexin V-FITC 和 5 μL 的 PI 染色液。 

4.轻柔涡旋混匀后,室温避光孵育 15~20 min。

5.反应完成后立即上机检测。如不能及时检测,请于冰上避光静置并于 1 小时内完成检测。注:a)流式细胞仪检测请取阴性样本(如未经药物处理的活细胞)进行 Annexin V-FITC 和 PI 双染,作为阴性对照;另取阳性样本(如毒性药物处理的细胞)分别进行 Annexin V-FITC 和 PI 单染,作为调节荧光补偿的单阳对照。b)流式细胞仪检测时 Annexin V-FITC 可用 FITC 通道,PI 优先选择 PerCP/Cy5.5 通道,其次是 ECD 通道。

两步法 

1.细胞按照实验方案进行凋亡诱导,300 g 离心 5 min,弃上清,收集细胞,PBS 洗涤一次,轻轻重悬细胞并计数。注:本品仅在悬浮培养的细胞中验证,良好的细胞状态是实验的关键。贴壁生长的细胞用于凋亡检测时,可能会因为胰酶消化、吹打等处理导致细胞的坏死或凋亡,对实验结果可能存在不可控的影响,请谨慎处理。 

2.取 1~5 × 105重悬的细胞,300 g 离心 5 min,弃上清。用 PBS 洗涤细胞一次,离心后弃上清,加入 100 μL 稀释的 1 × Annexin V Binding Buffer 工作液重悬细胞。 

3.细胞悬液中加入 2.5 μL 的 Annexin V-FITC 和 2.5 μL 的 PI 染色液。(由于两步法分辨率更高,染色液用量减半依然可得到媲美一步法的效果;用户亦可根据自己的模型进行滴定后加入适量的染色液,用更少的量获得高质量的结果。)4.轻柔涡旋混匀后,室温避光孵育 15~20 min。 

5.加入 400 μL 稀释的 1 × Annexin V Binding Buffer,混匀样本。

 6.立即上机检测。如不能及时检测,请于冰上避光静置并于 1 小时内完成检测。注:a)流式细胞仪检测请取阴性样本(如未经药物处理的活细胞)进行 Annexin V-FITC 和 PI 双染,作为阴性对照;另取阳性样本(如毒性药物处理的细胞)分别进行 FITC 和 PI 单染,作为调节荧光补偿的单阳对照。b)流式细胞仪检测时 Annexin V-FITC 可用 FITC 通道,PI 优先选择 PerCP/Cy5.5 通道,其次是 ECD 通道。


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